Ses études universitaires terminées, il découvre le monde du septième art en débutant comme comptable de production. Petit à petit, il gravit toutes les marches et devient tour à tour chansonnier, acteur et régisseur.

À partir de 1924, André Berthomieu devient assistant-réalisateur, notamment de Marcel Vandal, Maurice Gleize, Julien Duvivier et René Hervil. À l’orée des années trente, il commence à diriger des film. Pas si bête (1928), avec René Lefèvre (également scénariste), Jean Heuzé et Hubert Daix, est sa première réalisation, relatant les déboires d’un jeune paysan à Paris.

Véritable professionnel et très à cheval sur la règlementation de son activité, André Berthomieu devient le président du Syndicat des techniciens et de l’Association des auteurs de films, et ce, de 1945 à 1955. Comme syndicaliste, il se montre particulièrement actif. Il milite pour la structuration du secteur cinématographique, et son ouvrage Essai de grammaire cinématographique, paru en 1946, va dans ce sens.

Il n’hésite pas à lancer de jeunes acteurs, et il en raconte d’ailleurs un peu l’histoire dans Coquecigrole (1931), avec Danielle Darrieux dans le rôle principal. Dans ce film, un garçon de café recueille une orpheline et lui apprend le théâtre, mais le père de la jeune fille refait surface et l’enlève.

Il enchaîne avec La Femme idéale (1934) d’après le roman de GeorgeOudard, avec André Alerme, Mary Glory et André Lefaur. André Berthomieu porte à l’écran l’histoire d’un jeune homme timide qui s’éprend d’une jolie femme, passant aux yeux de ses collègues pour un véritable Don Juan.

Dans Jim la houlette, qu’il présente en 1935, Fernandel joue le rôle du nègre d’un écrivain prêt à tout pour doper les ventes du livre qu’il signe, allant jusqu’à faire courir le risque d’une condamnation à mort au premier. Le film rencontre un immense succès.

Line Noro est à l’affiche de sa comédie dramatique Le Secret de Madame Clapain (1943), où elle tient le rôle d’une dame qui se suicide chez deux demoiselles.

André Berthomieu réalise aussi des films policiers, à l’image de L’Ombre (1945) avec Fernand Ledoux et Renée Faure, une énigme autour d’un crime perpétré dans un immeuble et dont le principal suspect est un jeune locataire.

De toute l’œuvre d’André Berthomieu, deux films émergent réellement du lot : Mon ami Victor et Le Mort en fuite. En 1931, Mon ami Victor, avec dans les principaux rôles Simone Bourday, René Lefèvre et Pierre Brasseur, raconte l’histoire d’un jeune homme pauvre, mais de vieille noblesse, pris en charge par un arriviste cynique et calculateur a qui il sert de repoussoir. En 1936, LeMort en fuite réunit Mary Glory, Jules Berry et Michel Simon. Dans ce film, deux misérables cabotins, Trignol et Baluchet, se lancent dans un projet de simulation d’un meurtre.

Dans certains de ses films, André Berthomieu officie aussi comme scénariste : Les Ailes brisées (1933), N’aimer que toi (1934), Dédé la musique (1939), Amours, délices et orgues (1946), Carré de valets (1947), Pigalle-Saint-Germain-des-Près (1950), Belle mentalité (1952).

Il est en outre adaptateur (Mademoiselle Josette, ma femme, En légitime défense, Préméditation), dialoguiste (Chacun son tour en 1951, La Joyeuse prison en 1956), producteur (Le Portrait de son père ,1953), compositeur de musique (Le Crime du Bouif, 1932) et même interprète dans L’Œil en coulisse (1953).

André Berthomieu a réalisé près de soixante-dix films, mais une grande partie de son œuvre reste méconnue du grand public.

Il décède le 10 avril 1960 à Vineuil-Saint-Firmin dans l’Oise, à l’âge de cinquante-sept ans.